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处理时，观察到的类似累加效应（参见图的；有关该实验的更详细版本，包括额外的）突变体，参见补充图）。当作为单一、或达沙替尼联合使用时，以剂量依赖性方式降低表达的a/细胞中的rc和磷酸化（图；补充图）。对达沙替尼和厄洛替尼联合治疗有放射学反应的临床试验受试者中激酶结构域突变的观察最近报道了两项达沙替尼早期临床试验，其中晚期肺癌受试者接受达沙替尼或达沙替尼和厄洛替尼联合治疗,。名 肺鳞状细胞癌受试者中的一名在接受达沙替尼和 厄洛替尼联合治疗时，肿瘤大小显着缩小；与研究中对治疗有反应且患有腺癌的其他受试者不同，没有的证据在受试者中发现了突变。该患者是一位​​岁的白人女性，有年每天吸烟三分之一包的吸烟史，并在诊断出肺癌前一年戒烟。她被发现日本短信网关患有左下叶期（肿瘤，；淋巴结，；转移，）鳞状细胞癌，并接受每周一次 卡铂和紫杉醇初步治疗，同时接受y的放射治疗，获 得完全缓解。然而，大约一年后，疾病在放射野内进展，并开始使用标准剂量的卡铂和紫杉醇治疗，但没有反应。然后，她开始按照方案进行达沙替尼和厄洛替尼联合治疗。近个月后，重新分期计算机断层扫描扫描显示肿瘤缩 美国在线电子邮件列表 小，患者症状有所改善（呼吸困难和咳嗽得到缓解；图和）。她继续接受治疗方案个月，直到由于治疗引起的空腔疾病和胸腔积液而不得不停止治疗。图图患有突变的患者接受达沙替尼加厄洛替尼治疗后的放射学反

此；在转化时间或不依差异（补充图）。激酶死亡的转基因（）不支持a/细胞的独立生长（补充图）。尽管用效力较弱的抑制剂伊马替尼培养不会导致表达突变的a/细胞显着死亡，但与在存在下生长的细胞相比，用达沙替尼培养会导致所有表达突变体的细胞系死亡，突变体的平均为n，对照为μ（图；补充图）。第三代bl抑制剂也 更具靶点特异性的型抑制剂尼洛替尼和伊马 替尼更有效，我们试图测试达沙替尼在该系统中的效力是否可能是由于这些影响达沙替尼对以外的激酶的作用。先前已被证明需要rc才能发挥最批量短信孟加拉国大激酶活性，并且我们观察到，在缺乏的情况下，表达突变体的a/细胞中磷酸化rc的水平得以维持（补充图）。为了确定突变在a/细胞中赋予独立增殖的能力是否可能依赖于和rc活性，我们处理了表达与一起使用，是一种高度选择性的rc家族激酶抑制剂，与本 文中描述的其他抑制剂相比，其对的 活性最小（体外d，n；补充表；参考文献）。与尼洛替尼治疗一样，对不依赖的表达a/细胞的增殖有一定影响（补充图和）。然而，当表达突变的a/细胞在n尼罗替尼中生长时，该浓度对野生型a/细胞或表达的a/细胞的增殖几 美国在线电子邮件列表 乎没有影响突变（补充图），添加导致表达的a/细胞增殖显着减少；这一发现表明，突变的a/细胞在没有的情况下生长的能力可能需要和rc家族激酶的协调活性，从而为达沙替尼在该系统中的效力提供了可能的解

磷酸rc、磷酸、疫印迹。或达沙替尼，含或不含n；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。，用所示浓度的以及n尼罗替尼、或达沙替尼处理天的转化a/细胞的免疫印迹。第一泳道是未经处理的样品。显示的是用针对磷酸rc、磷酸、和肌动蛋白的抗体探测的免疫印迹。或达沙替尼，含或不含n；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。，用所示浓度的以及n尼罗替尼、或达沙替尼处理天的转化a/细胞的免疫 印迹。第一泳道是未经处理的样品 显示的是用针对 磷酸rc、磷酸、和肌动蛋白的抗体探测的免疫印迹。查看大图下载幻灯片突变体的异位表达会导致细胞转化，这种转化可以通过达沙替尼或联合酪氨酸激酶抑制剂治疗来阻断。，来自软琼脂测定的结果，其中将表达突变、突变或突变的成纤维细胞在存在不同浓度的达沙替尼的情况下置于软琼脂中。显示了具有的个独立样本的集落数。，仅表批量短信尼泊尔达载体或个中的个的a/细胞在天时的增殖在达沙替尼存在下生长的细胞中观察到的突变。对于载体， 对照细胞在存在的情况下生长以维持活力， 而对于突变体，所有细胞均不依赖 美国在线电子邮件列表 于，并在不存在的情况下培养。对于具有的一式三份样品，在同一时间点显示相对于未处理细胞的增殖。，表达的a/细胞与n尼洛替尼、或达沙替尼有或没有n共培养的增殖；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。、的免疫印迹转化的a/细胞用所示浓度的以及n尼洛替尼、或达沙替尼处理天。第一泳道是未经处理的样品。显示的是用针对磷酸rc、磷酸、和肌动蛋白的抗体探测的免疫印迹。由于在

每个队列的小鼠的代表性图像，以及肿瘤大小的测量结果。瘤；无法进一步分析这些小鼠。突变具有致癌性，驱动的转化对达沙替尼敏感我们检查了突变是否可以赋予致癌功能获得表型。在我们的初次和二次筛选中鉴定出的突变体子集的异位表达（nof）促进了细胞软琼脂中集落的形成（补充图）。和突变体中的集落形成最大，其水平与中功能获得性突变表达驱动的水平相当，而其余基因型中的集落形成则适中。对于突 变体，在铺板时单次施用达沙替尼即可抑制集落形成，该 突变体在我们的测定中可重复地形成最多集落（图））。达沙替尼治疗还抑制表达中突变的细胞的集落形成，与之前的报道一致，并且在稳定表达激活的突变的细胞中抑制程度较小（图；参考文献）。、）。图批量短信马来西亚图突变体的异位表达导致细胞转化，可通过达沙替尼或联合酪氨酸激酶抑制剂治疗来阻断。，软琼脂测定的结果，其中将表达突变、突变或突变的成纤维细胞在不同浓度的达沙替尼存在下铺板于软琼脂中。显示了具有的个独立样 本的集落数 仅表达载体或在达沙替尼存在下生长 的细胞中观察到的个突变之一的a/ 美国在线电子邮件列表 细胞在天时的增殖。对于载体，对照细胞在存在的情况下生长以维持活力，而对于突变体，所有细胞均不依赖于，并在不存在的情况下培养。对于具有的一式三份样品，在同一时间点显示相对于未处理细胞的增殖。，表达的a/细胞与n尼罗替尼、或达沙替尼（有或没有n）共培养的增殖；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。，用所示浓度的以及n尼罗替尼、或达沙替尼处理天的转化a/细胞的免疫印

据未显示）。我们观察到，这个sh敲低导致个突变细胞系的增殖减少，但少，在我们的增殖测定中，该细胞对伊马替尼和达沙替尼敏感。图）。增殖的减少似乎与敲低程度相关，因为用sh观察到的表型比sh更大（图），并且似乎是由细胞死亡而不是细胞周期停滞引起的（数据未显示）。为了评估观察到的敲低表型的特异性，我们在异位表达其所描述的突变形式（分别为和）的和细胞中进行了类似的实验，然后用sh敲低 内源，它针对的’非翻译区，预计不会干扰的异位表 达。我们在和中观察到的异位表达减弱了内源敲低的抗增殖作用，并且中的这种作用更为严重，这可能是由于中脱靶作用程度更大（图伊拉克短信网关）。突变与达沙替尼体内敏感性相关为了在更生理的环境中分析达沙替尼治疗的效果，我们在无胸腺裸鼠中进行了异种移植研究，其中我们向小鼠组注射了、、和细胞。细胞未在小鼠体内形成肿瘤，因此无法进一步分析。个测试系肿瘤形成后，小鼠通过口服强饲法用达沙替尼mg/kg治疗周，或用载体对照治疗。 达沙替尼治疗导致和细胞系的肿瘤大小减小，但 在中没有，这与我们的体外结果一致 美国在线电子邮件列表 （图）。图图鳞状肺癌细胞系的异种移植证明了达沙替尼的体内抗肿瘤作用。无胸腺nu/nu小鼠皮下注射、、和细胞n，并在肿瘤形成后用达沙替尼或载体治疗周。显示的是每个队列的小鼠的代表性图像，以及肿瘤大小的测量结果。注射的小鼠没有形成肿瘤；无法进一步分析这些小鼠。查看大图下载幻灯片鳞状肺癌细胞系的异种移植证明了达沙替尼的体内抗肿瘤作用。无胸腺nu/nu小鼠皮下注射、、和细胞

点未处理的细胞的增殖。显示一式三份样品的。，在中异位表达看增殖，标记为。中显示了达沙替尼存在下的天增殖。对于和，看门人突变与细胞系中发现的突变以顺式表达。，如中测量的、的增殖，细胞稳定表达sh载体，该载体靶向绿色荧光蛋白或的’sh或的编码序列sh。与第天相比，在培养天后测量增殖。显示了三次重复样品的。插图，免疫印迹显示实验中使用的细胞系中的相对水平。“”，表达sh的细胞；“”和“”是编号的目标发夹。，通过靶向’（sh）的sh敲低后，稳定表达异位的突变体和细胞系的天增殖。相对于用靶向的sh转导 的细胞，一式三份样品的增殖如图所示。的蛋白质 水平显示在下面的免疫印迹中。“”sh“，”sh的表达；和“”，sh和的表达。查看大图下载幻灯片具有突变的肺癌细胞系对针对的药物和干扰敏感。，在不同浓度的达沙替尼存在下生长天的、、和的增殖。显示相对于同一时间点未处理的细胞的短信群发缅甸增殖。显示一式三份样品的。，在中异位表达看门人突变的和细胞系的增殖，标记为。中显示了达沙替尼存在下的天增殖。对于和，看门突变与细胞系中发现的突变以顺式表达。，如中所示，针对稳定表达sh载体的、和细胞测量增殖，该载体靶向绿色荧光蛋白或的’sh或（sh）。与第天相比，在培养天后测量增殖。显示了三 次重复样品的。插图，免疫印迹显示实验中使用的细 胞系中的相对水平。“”，表达sh的细 美国在线电子邮件列表 胞；“”和“”是编号的目标发夹。，稳定表达异位的突变体和细胞系的天增殖通过靶，治疗比尼洛替尼治疗产生了更大程度的抑制，这一发现与体外计算的d值一致，尼洛替尼为n，为n，而达沙替尼为n（补充表）。靶向的sh杀死突变细胞系作为依赖性的独立测量，我们使用慢病毒载体在、和细胞系中表达靶向的sh。我们筛选了一组sh

癌样本进行测序可识别中的复发突变。，肺样本中突变的初级、次级和验证筛查。，的氨基酸序列，在已知的结构域结构中显示了已识别的突变位置。鉴近一项达沙替尼在肺癌患者中的药代动力学分析显示，在每日最大耐受剂量mg时，达沙替尼的峰值浓度在ng/mn范围内，该剂量已被批准用于治疗白血病。）。 在相同细胞系中进行测试时，伊马替尼的效力较低，的分别为和 突变的和细胞系（补充图）。达沙替尼和伊马替尼对细胞系的效果较差，已知该细胞系含有突变且没有任何突变（计算得出达沙替尼的为μ，伊马替尼为μ）。与之前的报告一致，包含扩增的细胞系对这两种药物均敏感，可作为我们测定的阳性对照批量短信泰国,）。值得注 意的是，癌症体细胞突变目录数据库中尚未报告或系 的其他体细胞突变来建议替代达沙替 美国在线电子邮件列表 尼靶点；之前的一份报告检查了种细胞系的药物敏感性，确定是对达沙替尼最敏感的肺系，尽管未对和进行测定。通过台盼蓝排除法测量，用达沙替尼处理突变细胞系似乎导致细胞死亡而不是细胞周期停滞（补充图）。达沙替尼治疗与细胞膜联蛋白染色增加相关，表明接受治疗的细胞因凋亡而死亡（数据未显示）。图图具有突变的肺癌细胞系对针对的药物和干扰敏感。，在不同浓度的达沙替尼存在

于是初次和二次筛选中最常见的突变基因，我们在队列中对进行了测序，产生了另外个突变样本，总体频率为（n在个总样本中，当排除细胞系时，原发性肺样本中的总体频率为（n中的个；图）。在激酶结构域和蛋白质序列的其他区域均发现了突变，并在处发现了个突变（图））。和突变分别在和细胞系中发现，其余突变在原代样本中发现。与的鼠类、斑 马鱼和秀丽隐杆线虫同源物相比，大多数突变位于氨 基酸高度保守的区域（补充图）。与正常肺或肺腺癌相比，对先前报告的拷贝数和基因表达数据集进行的额外基因组分析并未揭示任何在中过度表达的证据，我们也没有发现中的拷贝数变化（数据未显示；参考文献、）。对测序批量短信土耳其样本附带的有限临床信息的查询并未发现突变状态与患者年龄、性别或吸烟状况存在任何显着相关性。突变细胞系对酪氨酸激酶抑制剂选择性敏感为了评估靶向是否可能是肺的一种有前途的治疗策略，我们分析 了几种据报道可抑制的酪氨酸激酶抑制剂，包括伊马 替尼和达沙替尼，这两种药物已被批准用于临床用于靶向bl治疗慢性粒细胞白血病和急性白血病淋巴细胞白血病、胃肠道间质瘤中的c以及慢性粒单核细胞白血病中的血小板衍生生长因子受体,–。荧光共振能量转移测量提供了 美国在线电子邮件列表 重组的达沙替尼n和伊马替尼n的体外解离速率常数d值（补充表）达沙替尼对具有突变的细胞系表现出特别的功效，因为它抑制突变体和细胞的增殖，计算出的抑制浓度（）分别为和n（图）。值得注意的是，最

簇显着相关（p）。驱动程序改变在谱簇中显读数器iewuxerkinlmer测定细胞含量elliterloromega来克隆到petn载体中以产生无法复制的慢病毒。慢病毒感染后，通过用嘌呤开发（）。对激酶抑制剂有反应的患者更有可能患有的腺癌亚型（）。患有非小细胞肺癌另一患者很少对这些药物产生们还表明，突变具有致癌性，并且可以通过达沙替尼或酪氨酸激酶抑制剂组合治疗来阻断其转化 细胞的能力。此外，我们报告了肺鳞状细胞癌临床试 验受试者中的激酶结构域突变，该受试者对厄洛替尼和达沙替尼联合治疗有放射学反应，但没有突变。总之，这些数据表明可能是鳞批量短信菲律宾状细胞癌的重要治疗靶点。结果在肺中发生突变我们对最初的个原发性肺样本和匹配的正常对照中的个基因（包括整个酪氨酸激酶组）进行了桑格测序；我们在发现样本集中的个 基因中发现了体细胞错义突变，其中个位于酪氨 激酶基因中（图）。在n和酪氨酸激酶基因：n和激酶插入结构域受体；n；图中发现了复发性体细胞突变。随后对个突变酪氨酸激酶基因（、、、、和）进行测序，根据可能的治疗靶点进行选择，在个肺样本（包括个细胞系） 美国在线电子邮件列表 的二次筛选中，发现了个额外的突变（图）以及个突变、个和突变，以及和各有个突变。图。图鳞状肺癌样本的测序鉴定出中的复发突变。，肺样本中突变的初级、次级和验证筛选。，的氨基酸序列，在

增殖。对于软琼脂测定，将细胞分配在孔板中，在含有琼脂的固化培养基层上含有琼脂的生长培养基中。sh用多西环素诱导，并在铺板天后用刃天青染色评估集落形成。sh序列如下：sh。细胞系和原发性肿瘤的基因组分析详细描述可以参见arretina及其同事的报告（）；另见。简而言之，使用高密度阵列ffymetrix测量拷贝数，并使用基因模式管道eneatternpipeline将其标准化为拷贝数估计值（log比率；log比率等于标准化拷贝）（和hgffymetrix探针注释。使用算法识别样本特异性和重复的拷贝数变化。 根据制造商的说明，使用ffymetrixplus阵列获得m 表达水平。中的微阵列数据登录号是。c亚型m表达为aqan测定设计特异性监测c同工型表达的引物 探针：。对于内部对照，将β肌短信网关斯洛文尼亚动蛋白引物和探针（目录号：）与的引物和探针混合。使用 目录号），q热循环在°运行秒，°运行秒，°运行秒。来自人类原发性骨肉瘤样本的来自骨肉瘤的份基因组样本购自 癌症研究所（澳大利亚墨尔本；参考文献）。用于通过green测定确定拷贝数的引物为 研究是在诺华工厂进行的。所有原发性肿瘤样本均在手术时从 到了当地伦理委员会的批准。将肿瘤细胞或原发性 美国在线电子邮件列表 肿瘤的肿瘤碎片植入啮齿动物皮下。并在治疗过程中的指定时间监测肿瘤体积。数据以平均值±表示。使用单向方差分析和unnett检验进行组与媒介物对照组之间的比较。每个实验都标明了显着性水平。治疗结束时，切除肿瘤并在液氮中速冻。使用摇摆式研磨机（）粉碎冷冻组织，并在标准蛋白质裂解缓冲液中裂解肿瘤粉末以进行进一步的蛋白质印迹分析。激酶基因突变确定鳞状细胞肺癌的新治疗靶点彼得··哈默