Day: July 18, 2023

为n。文献检索并未发现任何关于埃罗替尼作为有效抑制剂的早期报道，我们在突变细胞系和中的初步实验表明，埃罗替尼的敏感性至少低倍高于对达沙替尼的敏感性（数据未显示）。总之，我们希望我们的数据可以刺激达沙替尼或其他酪氨酸激酶抑制剂在肺鳞状细胞癌患者中开展更大规模的临床试验，并对这些患者进行突变检测，从而有可能为这种致命疾病提供毒性更小、更有效的治疗方法。方法道德声明所有 动物实验均在达纳法伯癌症研究所（马萨诸塞州波 士顿）的机构动物护理和使用委员会批准的动物方案下进行，所有涉及人类的实验均按照机构审查委员会批准的方案进行：如下面所描述的。肺样本的采集对于初次和二次筛查，肿瘤样本是根据经anaarber/哈佛大学癌症中心批准的机构方案从anaarber癌症研究所/布莱根妇女医院/哈佛大学癌症中心（马萨诸塞州波士顿）获得的年加拿大酒店汽车旅馆电子邮件列表月发布，此后每年更新。这是一项通用组织采集方案，适用于同意在手术前采集组织用于研究（包括测序  的肺癌患者。所有具有可切除、活检证实的肺鳞状 细胞癌（由委员会认证的解剖病理学家诊断）的 美国在线电子邮件列表 患者均符合资格。这些符合条件的受试者在加入方案之前参加了详细的知情同意程序，其中包括讨论使用组织样本进行测序研究和书面同意文件。此外，从安大略癌症研究所获取了未识别的肺鳞状细胞癌患者的样本，用于初级和二级筛查，作为丹娜法伯/哈佛癌症中心批准收集未识别的肿瘤样本用于测序的一部分学习。对收集去识别化样本的批准取决于对所有外部站点当地批准的协议的审查

前正在进行中，对突变的促进细胞转化的确切机制尚不清楚。然而，的异位表达与转化的a/细胞中的和rc磷酸化相关，并且rc和的化学抑制似乎在转化的a/细胞中表现出累加（如果不是协同）效应，突变的机制激活下游信号传导尚不清楚。激酶结构域突变可能以与处模拟突变类似的方式改变的激酶活性。观察到野生型的异位表达足以转化a/细胞，这表明信号传导活性的增加是潜在的转化机制。 的盘状蛋白结构域或未分类区域中的突变也有 可能影响的配体结合或定位；先前的报告表明，家族性脊椎骨骺发育不良中的突变会改变的配体结合和膜运输,。除了讨论激酶基因中广告营销机构电子邮件列表复发性体细胞突变的鉴定之外，我们还表明达沙替尼可以在体外和体内有效抑制突变的细胞系以及异位表达突变的细胞的增殖。总之，这些数据确定了肺鳞状细胞癌的潜在第一个治疗靶点，该靶点已经存在临床批准的药物，从而为酪氨酸激酶抑制剂的临床试验提供了理论基础。我们还报告了一名肺患者的 激酶结构域突变，该患者对达沙替尼和厄洛替尼组合表 现出放射学反应，但不携带突变。尽管这是一个有趣的 美国在线电子邮件列表 结果，但我们认为在解释时应谨慎，因为试验中一名鳞状细胞癌患者仅报告了例反应，从而排除了对相关性的彻底评估。此外，受试者在治疗个月后因出现不可接受的毒性而停止治疗，这表明有必要对达沙替尼以外的酪氨酸激酶抑制剂进行研究。尽管不可能明确得出该患者因突变而对达沙替尼治疗产生特异性反应的结论，但鉴于不存在激酶结构域突变以及之前提到的情况，我们认为

的激酶活性（补充图）。讨论我们报告在个样个新突变，所有样本中的总体突变率为，原发性中的总体突变率为，这一比率与携带融合的肺腺癌患者的比例相当。与抑制剂克唑替尼的显着反应相关的基因组事件,。目前，突变是否主要出现在肺部鳞状细胞癌中，或者它们是否可能存在于源自 其他组织的鳞状细胞癌中，例如头颈、皮肤或不同部位 的肿瘤，这仍然是一个重要的问题。组织学类型。此外，的速率我们的验证筛选中的突变率低于我们最初的突变筛选，并且可能需要额外的测序工作（例如即将推出的癌症基因组图谱）来进一步确定突变的患病率。值得注意的是，我们在子宫内金属煤矿电子邮件列表膜癌样本集中发现了个额外的突变（和），以及结直肠癌患者的突变（），支持突变可能存在于多种癌症类型中的可能性。对数据库的搜索中，值得注意的是肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤和前面提到的肺腺癌样本中的突变。此外，我们的初次和二次筛选主要由来自美国的样本组成，而验证筛选则由更多来自欧洲患者的样本组成， 这表明人口统计数据也可能影响观察到的突变率 最近的一份报告使用错配修复技术对例鳞状细胞肺 美国在线电子邮件列表 癌队列中超过个基因进行了测序，没有发现任何突变；然而，我们计算得出样本量不够大，无法检测速率的统计显着差异与我们的研究相比，假设幂为，α为。我们评估了种突变形式在细胞和a/细胞中异位表达的影响，结果表明突变的在这两种情况下都可以作为癌基因发挥作用，尽管效力不同。我们没有完成对所有已识别的突变体的评估，也没有在小鼠或其他模型生物的原代鳞状肺细胞的

机断层扫描图像。在化疗时、达沙替尼和厄洛替尼研究治疗开始时以及达沙替尼加厄洛替尼治疗个月后显示连续扫描。，顶部，中受试者的肿瘤尺寸测量，从化疗治疗前个月开始，一直延伸到达沙替尼和厄洛替尼联合治疗停止时。底部条形图描绘了根据实体瘤疗效评估标准在化疗前、 化疗后以及达沙替尼加厄洛替尼治疗个月后测量的肿 瘤体积。查看大图下载幻灯片患有突变的患者接受达沙替尼加厄洛替尼治疗后的放射学反应。，来自一位肺患者接受化疗、随后接受达沙替尼加厄洛替尼治疗的计算机断层扫描图像。在化疗时、达沙替尼和厄洛替尼研究治疗开始时以及达沙替尼加厄洛替尼治疗个月后显示连续扫描。，顶部，中受试者的肿瘤尺寸测量值，从化疗前个月开始，一石油和天然气电子邮件列表直延续到达沙替尼和厄洛替尼联合治疗停止时。底部条形图描绘了根据实体瘤疗效评估标准在 化疗前、化疗后以及达沙替尼加厄洛替尼治疗个月后 测量的肿瘤体积。理肿瘤样本中进 美国在线电子邮件列表 行了定向测序，并鉴定了一种新的激酶结构域突变，该突变存在于通过次测序（数据未显示）获得的条读数中的条（）中，并进行了独立验证通过桑格测序（补充图）。该突变无法被证实为体细胞突变，因为该死者没有正常。这种相关性无法进一步探讨，因为没有其他鳞状细胞癌受试者对本研究中的治疗或随后单独使用达沙替尼的治疗有反应（n总共个）。我们在激酶结构域的

处理时，观察到的类似累加效应（参见图的；有关该实验的更详细版本，包括额外的）突变体，参见补充图）。当作为单一、或达沙替尼联合使用时，以剂量依赖性方式降低表达的a/细胞中的rc和磷酸化（图；补充图）。对达沙替尼和厄洛替尼联合治疗有放射学反应的临床试验受试者中激酶结构域突变的观察最近报道了两项达沙替尼早期临床试验，其中晚期肺癌受试者接受达沙替尼或达沙替尼和厄洛替尼联合治疗,。名 肺鳞状细胞癌受试者中的一名在接受达沙替尼和 厄洛替尼联合治疗时，肿瘤大小显着缩小；与研究中对治疗有反应且患有腺癌的其他受试者不同，没有的证据在受试者中发现了突变。该患者是一位​​岁的白人女性，有年每天吸烟三分之一包的吸烟史，并在诊断出肺癌前一年戒烟。她被发现日本短信网关患有左下叶期（肿瘤，；淋巴结，；转移，）鳞状细胞癌，并接受每周一次 卡铂和紫杉醇初步治疗，同时接受y的放射治疗，获 得完全缓解。然而，大约一年后，疾病在放射野内进展，并开始使用标准剂量的卡铂和紫杉醇治疗，但没有反应。然后，她开始按照方案进行达沙替尼和厄洛替尼联合治疗。近个月后，重新分期计算机断层扫描扫描显示肿瘤缩 美国在线电子邮件列表 小，患者症状有所改善（呼吸困难和咳嗽得到缓解；图和）。她继续接受治疗方案个月，直到由于治疗引起的空腔疾病和胸腔积液而不得不停止治疗。图图患有突变的患者接受达沙替尼加厄洛替尼治疗后的放射学反

此；在转化时间或不依差异（补充图）。激酶死亡的转基因（）不支持a/细胞的独立生长（补充图）。尽管用效力较弱的抑制剂伊马替尼培养不会导致表达突变的a/细胞显着死亡，但与在存在下生长的细胞相比，用达沙替尼培养会导致所有表达突变体的细胞系死亡，突变体的平均为n，对照为μ（图；补充图）。第三代bl抑制剂也 更具靶点特异性的型抑制剂尼洛替尼和伊马 替尼更有效，我们试图测试达沙替尼在该系统中的效力是否可能是由于这些影响达沙替尼对以外的激酶的作用。先前已被证明需要rc才能发挥最批量短信孟加拉国大激酶活性，并且我们观察到，在缺乏的情况下，表达突变体的a/细胞中磷酸化rc的水平得以维持（补充图）。为了确定突变在a/细胞中赋予独立增殖的能力是否可能依赖于和rc活性，我们处理了表达与一起使用，是一种高度选择性的rc家族激酶抑制剂，与本 文中描述的其他抑制剂相比，其对的 活性最小（体外d，n；补充表；参考文献）。与尼洛替尼治疗一样，对不依赖的表达a/细胞的增殖有一定影响（补充图和）。然而，当表达突变的a/细胞在n尼罗替尼中生长时，该浓度对野生型a/细胞或表达的a/细胞的增殖几 美国在线电子邮件列表 乎没有影响突变（补充图），添加导致表达的a/细胞增殖显着减少；这一发现表明，突变的a/细胞在没有的情况下生长的能力可能需要和rc家族激酶的协调活性，从而为达沙替尼在该系统中的效力提供了可能的解

磷酸rc、磷酸、疫印迹。或达沙替尼，含或不含n；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。，用所示浓度的以及n尼罗替尼、或达沙替尼处理天的转化a/细胞的免疫印迹。第一泳道是未经处理的样品。显示的是用针对磷酸rc、磷酸、和肌动蛋白的抗体探测的免疫印迹。或达沙替尼，含或不含n；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。，用所示浓度的以及n尼罗替尼、或达沙替尼处理天的转化a/细胞的免疫 印迹。第一泳道是未经处理的样品 显示的是用针对 磷酸rc、磷酸、和肌动蛋白的抗体探测的免疫印迹。查看大图下载幻灯片突变体的异位表达会导致细胞转化，这种转化可以通过达沙替尼或联合酪氨酸激酶抑制剂治疗来阻断。，来自软琼脂测定的结果，其中将表达突变、突变或突变的成纤维细胞在存在不同浓度的达沙替尼的情况下置于软琼脂中。显示了具有的个独立样本的集落数。，仅表批量短信尼泊尔达载体或个中的个的a/细胞在天时的增殖在达沙替尼存在下生长的细胞中观察到的突变。对于载体， 对照细胞在存在的情况下生长以维持活力， 而对于突变体，所有细胞均不依赖 美国在线电子邮件列表 于，并在不存在的情况下培养。对于具有的一式三份样品，在同一时间点显示相对于未处理细胞的增殖。，表达的a/细胞与n尼洛替尼、或达沙替尼有或没有n共培养的增殖；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。、的免疫印迹转化的a/细胞用所示浓度的以及n尼洛替尼、或达沙替尼处理天。第一泳道是未经处理的样品。显示的是用针对磷酸rc、磷酸、和肌动蛋白的抗体探测的免疫印迹。由于在

每个队列的小鼠的代表性图像，以及肿瘤大小的测量结果。瘤；无法进一步分析这些小鼠。突变具有致癌性，驱动的转化对达沙替尼敏感我们检查了突变是否可以赋予致癌功能获得表型。在我们的初次和二次筛选中鉴定出的突变体子集的异位表达（nof）促进了细胞软琼脂中集落的形成（补充图）。和突变体中的集落形成最大，其水平与中功能获得性突变表达驱动的水平相当，而其余基因型中的集落形成则适中。对于突 变体，在铺板时单次施用达沙替尼即可抑制集落形成，该 突变体在我们的测定中可重复地形成最多集落（图））。达沙替尼治疗还抑制表达中突变的细胞的集落形成，与之前的报道一致，并且在稳定表达激活的突变的细胞中抑制程度较小（图；参考文献）。、）。图批量短信马来西亚图突变体的异位表达导致细胞转化，可通过达沙替尼或联合酪氨酸激酶抑制剂治疗来阻断。，软琼脂测定的结果，其中将表达突变、突变或突变的成纤维细胞在不同浓度的达沙替尼存在下铺板于软琼脂中。显示了具有的个独立样 本的集落数 仅表达载体或在达沙替尼存在下生长 的细胞中观察到的个突变之一的a/ 美国在线电子邮件列表 细胞在天时的增殖。对于载体，对照细胞在存在的情况下生长以维持活力，而对于突变体，所有细胞均不依赖于，并在不存在的情况下培养。对于具有的一式三份样品，在同一时间点显示相对于未处理细胞的增殖。，表达的a/细胞与n尼罗替尼、或达沙替尼（有或没有n）共培养的增殖；增殖是相对于平行生长的未处理细胞而言的。，用所示浓度的以及n尼罗替尼、或达沙替尼处理天的转化a/细胞的免疫印

据未显示）。我们观察到，这个sh敲低导致个突变细胞系的增殖减少，但少，在我们的增殖测定中，该细胞对伊马替尼和达沙替尼敏感。图）。增殖的减少似乎与敲低程度相关，因为用sh观察到的表型比sh更大（图），并且似乎是由细胞死亡而不是细胞周期停滞引起的（数据未显示）。为了评估观察到的敲低表型的特异性，我们在异位表达其所描述的突变形式（分别为和）的和细胞中进行了类似的实验，然后用sh敲低 内源，它针对的’非翻译区，预计不会干扰的异位表 达。我们在和中观察到的异位表达减弱了内源敲低的抗增殖作用，并且中的这种作用更为严重，这可能是由于中脱靶作用程度更大（图伊拉克短信网关）。突变与达沙替尼体内敏感性相关为了在更生理的环境中分析达沙替尼治疗的效果，我们在无胸腺裸鼠中进行了异种移植研究，其中我们向小鼠组注射了、、和细胞。细胞未在小鼠体内形成肿瘤，因此无法进一步分析。个测试系肿瘤形成后，小鼠通过口服强饲法用达沙替尼mg/kg治疗周，或用载体对照治疗。 达沙替尼治疗导致和细胞系的肿瘤大小减小，但 在中没有，这与我们的体外结果一致 美国在线电子邮件列表 （图）。图图鳞状肺癌细胞系的异种移植证明了达沙替尼的体内抗肿瘤作用。无胸腺nu/nu小鼠皮下注射、、和细胞n，并在肿瘤形成后用达沙替尼或载体治疗周。显示的是每个队列的小鼠的代表性图像，以及肿瘤大小的测量结果。注射的小鼠没有形成肿瘤；无法进一步分析这些小鼠。查看大图下载幻灯片鳞状肺癌细胞系的异种移植证明了达沙替尼的体内抗肿瘤作用。无胸腺nu/nu小鼠皮下注射、、和细胞

点未处理的细胞的增殖。显示一式三份样品的。，在中异位表达看增殖，标记为。中显示了达沙替尼存在下的天增殖。对于和，看门人突变与细胞系中发现的突变以顺式表达。，如中测量的、的增殖，细胞稳定表达sh载体，该载体靶向绿色荧光蛋白或的’sh或的编码序列sh。与第天相比，在培养天后测量增殖。显示了三次重复样品的。插图，免疫印迹显示实验中使用的细胞系中的相对水平。“”，表达sh的细胞；“”和“”是编号的目标发夹。，通过靶向’（sh）的sh敲低后，稳定表达异位的突变体和细胞系的天增殖。相对于用靶向的sh转导 的细胞，一式三份样品的增殖如图所示。的蛋白质 水平显示在下面的免疫印迹中。“”sh“，”sh的表达；和“”，sh和的表达。查看大图下载幻灯片具有突变的肺癌细胞系对针对的药物和干扰敏感。，在不同浓度的达沙替尼存在下生长天的、、和的增殖。显示相对于同一时间点未处理的细胞的短信群发缅甸增殖。显示一式三份样品的。，在中异位表达看门人突变的和细胞系的增殖，标记为。中显示了达沙替尼存在下的天增殖。对于和，看门突变与细胞系中发现的突变以顺式表达。，如中所示，针对稳定表达sh载体的、和细胞测量增殖，该载体靶向绿色荧光蛋白或的’sh或（sh）。与第天相比，在培养天后测量增殖。显示了三 次重复样品的。插图，免疫印迹显示实验中使用的细 胞系中的相对水平。“”，表达sh的细 美国在线电子邮件列表 胞；“”和“”是编号的目标发夹。，稳定表达异位的突变体和细胞系的天增殖通过靶，治疗比尼洛替尼治疗产生了更大程度的抑制，这一发现与体外计算的d值一致，尼洛替尼为n，为n，而达沙替尼为n（补充表）。靶向的sh杀死突变细胞系作为依赖性的独立测量，我们使用慢病毒载体在、和细胞系中表达靶向的sh。我们筛选了一组sh

癌样本进行测序可识别中的复发突变。，肺样本中突变的初级、次级和验证筛查。，的氨基酸序列，在已知的结构域结构中显示了已识别的突变位置。鉴近一项达沙替尼在肺癌患者中的药代动力学分析显示，在每日最大耐受剂量mg时，达沙替尼的峰值浓度在ng/mn范围内，该剂量已被批准用于治疗白血病。）。 在相同细胞系中进行测试时，伊马替尼的效力较低，的分别为和 突变的和细胞系（补充图）。达沙替尼和伊马替尼对细胞系的效果较差，已知该细胞系含有突变且没有任何突变（计算得出达沙替尼的为μ，伊马替尼为μ）。与之前的报告一致，包含扩增的细胞系对这两种药物均敏感，可作为我们测定的阳性对照批量短信泰国,）。值得注 意的是，癌症体细胞突变目录数据库中尚未报告或系 的其他体细胞突变来建议替代达沙替 美国在线电子邮件列表 尼靶点；之前的一份报告检查了种细胞系的药物敏感性，确定是对达沙替尼最敏感的肺系，尽管未对和进行测定。通过台盼蓝排除法测量，用达沙替尼处理突变细胞系似乎导致细胞死亡而不是细胞周期停滞（补充图）。达沙替尼治疗与细胞膜联蛋白染色增加相关，表明接受治疗的细胞因凋亡而死亡（数据未显示）。图图具有突变的肺癌细胞系对针对的药物和干扰敏感。，在不同浓度的达沙替尼存在

于是初次和二次筛选中最常见的突变基因，我们在队列中对进行了测序，产生了另外个突变样本，总体频率为（n在个总样本中，当排除细胞系时，原发性肺样本中的总体频率为（n中的个；图）。在激酶结构域和蛋白质序列的其他区域均发现了突变，并在处发现了个突变（图））。和突变分别在和细胞系中发现，其余突变在原代样本中发现。与的鼠类、斑 马鱼和秀丽隐杆线虫同源物相比，大多数突变位于氨 基酸高度保守的区域（补充图）。与正常肺或肺腺癌相比，对先前报告的拷贝数和基因表达数据集进行的额外基因组分析并未揭示任何在中过度表达的证据，我们也没有发现中的拷贝数变化（数据未显示；参考文献、）。对测序批量短信土耳其样本附带的有限临床信息的查询并未发现突变状态与患者年龄、性别或吸烟状况存在任何显着相关性。突变细胞系对酪氨酸激酶抑制剂选择性敏感为了评估靶向是否可能是肺的一种有前途的治疗策略，我们分析 了几种据报道可抑制的酪氨酸激酶抑制剂，包括伊马 替尼和达沙替尼，这两种药物已被批准用于临床用于靶向bl治疗慢性粒细胞白血病和急性白血病淋巴细胞白血病、胃肠道间质瘤中的c以及慢性粒单核细胞白血病中的血小板衍生生长因子受体,–。荧光共振能量转移测量提供了 美国在线电子邮件列表 重组的达沙替尼n和伊马替尼n的体外解离速率常数d值（补充表）达沙替尼对具有突变的细胞系表现出特别的功效，因为它抑制突变体和细胞的增殖，计算出的抑制浓度（）分别为和n（图）。值得注意的是，最